组织研碎后Trizol一般裂解多长时间

  trizol说明书里好像不是很详细,用起来效果也一般。还是往圣的typhon好用,说明书也很详细。

  氯仿,异丙醇,75%乙醇,无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。

  a、组织:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml Typhon;肝脏、脑等柔软组织用匀浆仪进行匀浆处理。然后加入1mlTyphon,反复轻柔吹打,直至溶液不抽丝,样品体积不应超过Typhon体积10%。

  b、单层培养细胞:去除细胞培养基,PBS冲洗一次,直接在培养板中加入Typhon裂解细胞,每250px2面积加1ml,用移液器吸打几次,转移至1.5ml离心管,反复吹打,直至溶液不抽丝。Typhon的用量应根据培养板面积而定。Typhon加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

  c、细胞悬液:离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Typhon,反复吸打直至溶液不抽丝。加Typhon之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

  2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。

  3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃ 12000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除,取澄清的匀浆液进行下一步操作。

  4.第一步每使用1ml Typhon加入0.2ml氯仿,轻柔振荡或吹吸15秒,室温放置3分钟。

  5.2-8℃ 12000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色或淡黄色水相,中间为固相。RNA主要在水相中,水相体积约为所用Typhon试剂的60%。

  6.把水相转移到新管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Typhon加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。

  7.2-8℃ 10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

  9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,不要晾得过干,否则不易溶解,大约晾5-10分钟。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS(本公司均有售),用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解。-70℃保存。

  1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800μl Typhon匀浆样品,离心取上清液后,异丙醇沉淀RNA前加5-10ug RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。

  2.匀浆后加入Typhon,加氯仿之前样品可在-60—-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5—-20℃一年以上。

  3.分层和RNA沉淀时也可使用低速台式离心机,2600×g离心30-60分钟。

  A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。

  B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

  沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1mlTyphon在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,加入以上操作步骤。

  1.样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTyphon加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2-8℃不超过2000×g离心5分钟。

  2.移去上清,(如需要分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTyphon加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,2-8℃2000×g离心5分钟,弃上清,重复一次。

  4.室温放置晾干DNA5-15分钟,用8mMNaOH溶解DNA。从50-70mg组织或10细胞中分离的DNA溶于300-600μl8mMNaOH,DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE、HEPES调节pH。从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物,可12000×g离心10分钟除去。

  取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。理论上,人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量约分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。

  3.DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置过夜,如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM可置于4℃或-20℃长期保存。

  B.酚除去不彻底,可用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)再洗一遍DNA沉淀。

  B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

  1.取沉淀DNA后剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTyphon加1.5ml异丙醇,室温放置10分钟,2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。

  2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTyphon加2ml洗涤液,室温放置20分钟,2-8℃7500×g离心5分钟,弃上清,重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。

  3.线%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃水浴使其完全溶解,不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Westernblot或-5--20℃保存备用。

  1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5--20℃一年以上。


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